MOB 605

Tentti 15.11.2000

Lue kysymykset huolellisesti! Vastaa vain, mitä on kysytty! Tarvittavia tietoja löytyy liitteistä.

1. Miten tekisit TA-vektorin pBluescript-plasmidista ja miten valmistaisit kloonattavan insertin? Millaisia entsyymejä tarvitset niitä valmistaessasi? Selitä työvaiheet loogisessa järjestyksessä.

/3p

2. Digestoit 1µg:n pPyörylä-pIasmidia (c - 2 mg/ml) Smal entsyymillä. Ystäväsi auttaa sinua reaktion suunnittelussa ja antaa seuraavanlaisen ohjeen:

l,0 µl pStuff
5,5 µl H2O
2,0 µl l0 X buffer'D
0,5 µl Smal (10 U / µl)
10,0 µl

inkuboit 37aC:ssa 2h

Tarkista ohje ja korjaa mahdolliset virheet. Selitn muutokset.

/5p

3. Sinulla on 5 µg:n DNA-näyte 400 µl:ssa vettä. Tarvitset seuraavassa työvaiheessasi DNA:ta konsentraatiossa 50 ng/µl. Miten toimii (yksityiskohtaiset reaktiot tilavuuksineen ja konsentraatioineen), kun DNA:si häviää käsittelyn aikana 20 %?

/3p

4. Näyte on eristetty entsymaattisesti bakteereista. Kerro pääperiaatteiltaan mihin DNA puhdistaminen perustuu ja miten nukkiinihappo-vyöhykkeet asettuval CsCl-fuugauksessa?

/4p

5. Luettele ja määrittele lyhyesti:

a. Ligaation ja transformaation kontrollit
b. dideoksinukleotidit
c. 3' to 5' eksonukleaasiaktiivisuus
d. satelliittipesäkkeet
e. Tähtiaktiivisuus (Star activity)
f.. Tylsä entsyymi
g. alfa-komplementaatio

/6p

MOB605 Tentti I 15.11.2000 oikeat vastaukset:

1.

pBluescript linearisoidaan bluntit päät jättävällä entsyymillä, esim. EcoRV. Jos käytetään yliroikkuvia päitä jättävää entsyymiä, päät bluntataan täyttämättä tai ssDNA:ta syövällä nukleaasilla.

-lis, DNA-polymeraasia (jotakin settaista, jolla ei ole 3'-5’ eksonukleaasiaktiivisuutta ja jolla on teminaalitransferaasiaktiivisuutta; esim. DynaZyme tai Taq) sekä dTTP:tä -> polymeraasi lisaä T-overhangit vekiorin päihin

-insertti PCR:rätään samanlaisella polymeraasilla, jolloin insertin päihin saadaan A-overhangit

2.

1,0 µl pStuff -> pitää olla 0.5 µl, jotta digestoitava määrä on 1 µg
5,5 µl H₂O -> pitää olla 8.0 µl, jotta kokonastilavuus 10 µl
2,0 µl 10 X bu D -> pitää olla bu J, 1,0 µl
0,5 µl Smal
10,0 µl

ink, +37°C 2h -> inkubaatiolämpötila +25°C

3.

Konsentroidaan DNA EtOH-saostuksella. Esim:

lis. 40 µl (-1/10 vol) 3M Na-asetaatti + 880 µl jääkylmää abs. EtOH

-> ink. jäillä 15 min., fuugaus 15min -> pelletin pesu 70% EtOH:lla

-> pelletin kuivaus --> liuotus H₂O tai TE

Tilavuus johon liuotetaan: 20% DNA:sta menetetään saostuksessa -> jäljelle jää 4 µg

-> liuotetaan 80 µl:iaan. jolloin loppukonsentraatio on 50 ng/µl.

4.

Pääperiaate: EtBr:n sitoutuessa DNA:han sen noste kasvaa. CsCl-ionit paimuvat fuugauksessa putken pohjaa kohti muodostaen tiheysgradientin. DNA-vyöhykkeet jäävät kokonsa ja konformaationsa mukaisesti en kohtiin gradienttina
Bändien järjestys (ylhäältä alas): kromosomaalinen DNA, nickautunut plasmidi, superkoilautunut plasmidi, RNA pohjalla.

5.

a.

Ligaaliukontrollit:

- ligaaliokonrolli: l/HindIII, EcoR1 -DNA ± oma näyte -> kontrolloi ligaasin toimintaa ko. olosuhteissa

- vektorikontrolli: ligoidaan vektoria ilman inserttiä -> kontrolloi vektoritaustaa (c. -kontrolliligaatio: TA-kloonaukseen on saatavana kontrolli-inserttiä, jossa on A-overhangit; tällä voidaan kontrolloida TA-vektorin toimintaa)

Transformaatiokontrollit:

- konrrolliplasmidilla: transformaation onnistuminen ja transformaatioaktiivisuus

- solukontrollit: amp -> ei kontaminaatiota, LB -> solut elinkykyisiä

b.

nukleotidi, jonka 3’-asemasta puuttuu OH-ryhmä, ja terminoi täten DNA-synteesin. Käytetään DNA:n sekvensoinnissa.

c.

”proofreading”-aktiivisuus; DNA-polymeraasin kyky "oikolukea” syntetisoimaansa DNA:ta siten, että polymeraasi pystyy tunnistamaan ja poistamaan virheellisesti inkorpotoidut nukleotidit 3’-5'-suunnassa (eli palaamaan taaksepäin).

d.

bakteeripesäkkeitä, jotka kasvavat antibioottimaljalla transformanttipesäkkeiden

"siivetta" -alueetta, josta antibiootti on hajonnut; eivät itse sisällä resistenssiä antavaa plasmidia.

e.

restriktioentyymin aktiivisuus sittoin, kun sen spesifisyys on alentunut; entsyymi pilkkoo DNA:ta kohdista, jotka muistuttavat normaalia tunnistusekvenssiä.

f.

entsyymi, joka toimii jos on toimiakseen, useimmiten ei. Ei suositella kenenkaän käytettäväksi,

mutta voi ajottan ilmestyä kontaminaationa reaktioseokseen, mikäli tutkimuksessa ei ole mitään mieltä. Seurauksena on tylsiä päitä, jotka voivat aiheuttaa sensitiivisyyttä siperialaista hyppykuppaa kohtaan. Tylsäpäiset aiheuttavat harmillista taustaa säilymällä elinkykyisinä teräväpäisten välittömässä läheisyydessä (Vrt. kohta d).

g.

plasmidin mukana bakteerisoluun siirretty b-Laktamaasientsyymin a-fragmentti täydentää (komplementoi) isäntäsolun puutteettisen b-laktamaasikompleksiin. Mahdollistaa transformanttien sinivalkoseulonnan.