Biokemian harjoitustyöt I-III, loppukuulustelu 12.10.1995
1. Puhdistat glutamiinisyntetaasia (GS) vehnänjyväuuttesta Sepharose-anti-GS -pylväällä. Eluoit näytteen 4 M MgCl2:lla, jonka jälkeen dialysoit sen. Puhdistuksen kuluessa saat seuraavat proteiinimäärät ja aktiivisuudet:
|
|
prot. /mg |
akt. /U |
|
1. raakauute |
956 |
2157 |
|
2. eluution jälkeen |
1,17 |
613 |
|
3. dialyysin jälkeen |
0,98 |
596 |
Tee puhdistustaulukko, jossa näkyvät jokaisen näytteen saalis-%, spesifinen aktiivisuus ja puhdistumiskerroin. Merkitse laskutoimitukset yksiköineen näkyviin. Mihin kromatografiatyyppiin puhdistus perustuu tässä tapauksessa? Perustele. Miten kommentoit puhdistusvaiheiden tehokkuutta ja merkitystä?
2. Määritä pelkistetyn sytokromi c:n absorptiviteetti SEKÄ molaarinen absorptiviteetti (l 550nm:ssa) kun:
|
- liuoksen pitoisuus |
300 m g/ml |
|
- sytokromi c:n puhtaus (w/w) |
95 % |
|
- kyvetin valotie |
10 mm |
|
- sytokromi c:n molekyylipaino |
12.3 kD |
|
- pelkistetyn syt. c:n absorbanssi (549 nm:ssa) |
0.505 |
|
- hapetetun syt. c:n absorbanssi (549 nm:ssa) |
0.105 |
|
- Avogadron luku |
6.02x1023 |
Merkitse laskutoimitukset ja yksiköt näkyviin.
3. a) Selitä lyhyesti SDS-PAGEn ja immunoblottauksen periaate.
3. b) Mikä on aktiivisuusmäärityksen periaate, kun mittaat happaman fosfataasin aktiivisuutta käyttäen substraattina p-nitrofenyylifosfaattia?
4. Selitä entsyymeillä esiintyvät inhibitiotyypit. Miten kukin niistä vaikuttaa reaktion maksiminopeuteen ja Km-arvoon?